光与生物样品的相互作用

生物样品对光的吸收: 光在通过生物样品时由于部分光能转换成电子、分子的某种运动或热运动从而导致光强度的衰减。

一般吸收：    对一定光谱范围内的所有波长的光的衰减程度相同或相似

选择性吸收：只对某些特定波长的光有吸收或吸收比较强

比如：角膜和晶状体在可见光波段近似于透明体，但在红外波段表现出强烈的吸收

生物组织的光学透明窗口

光学透明窗口只由吸收决定吗？

答案是否定的，另外一个重要的因素就是散射

如果待测样品的折射率不均匀尺度远大于光波长的数量级，例如处理样品边界、样品和探测器之间的区域时，则发生折射，反射等宏观的效应。此时更多考虑光的波动性。

如果尺度达到光波长数量级的待测样品小块间存在折射率的较大差异，光线除了按照几何光学规律传播发生反射和折射外，还会发生散射。此时更多考虑光的粒子性，同时待测样品也要被看作是由亚微米或微米量级尺度的离散颗粒组成。

光散射：

1、弹性散射：入射和散射光子频率相同

                   如瑞利散射，米散射

2、非弹性散射：入射和散射光子频率不同

                   如拉曼散射，布里渊散射

散射光的强度与波长的四次方成反比，

   即散射光的强度随波长增加而减小。

散射强度比瑞利散射大得多

 对波长的依赖性弱。

 散射粒子的尺寸与光波长相近时，散射光强度的对称性被破坏。散射具有强烈的前向趋势，且随着颗粒尺寸的增加，散射的前向趋势也随之增大

生物样品对光的散射：

瑞利散射、米散射、散射截面、散射系数。

在小于800 nm的波段内，水的吸收系数均小于0.026 cm-1，说明光在水中传输100 cm后，至少还剩余约7%的光强。

在1460 nm处，水的吸收系数约为28.4 cm-1，说明光在水中传输1 mm，只剩余原来约6%的光强。

传统的生命科学荧光显微镜荧光信号位于蓝、绿、红光波段，在生物组织中的散射衰减较大，因此，只能实现活细胞和薄组织的成像，对活体生物样品（如小鼠、大鼠甚至非人灵长类等）的观测显得无能为力。

原理上可见光由于强吸收和散射无法进行，有效深度的探测，而在近红外波段进行生物体组织内部成像。

开启了新一代活体成像窗口。

弹道光和蛇形光携带了组织内部信息，属于有用信号；而散射光子则属于背景信号，会降低图像信背比，不利于清晰成像。

吸收损耗决定系统能否捕捉到信号，而散射信号会降低图像的清晰度。

目标就是最小吸收和最小散射光的成像窗口。

NIR-Ⅱ在活体成像中，具有较低的光子散射以及接近零的组织自身荧光，因此具有高时间分辨率、高空间分辨率、高信背比、大深度组织穿透的优势。

传统生物成像

可见光

360-760nm

近红外一区NIR-Ⅰ

760-900nm

新兴生物成像

近红外二区NIR-Ⅱ

900-1880nm

灵敏度高、时间分辨率好、实时宽场图像

存在穿透能力低、自发荧光干扰、空间分辨率低

主体选型：正置荧光成像显微镜

1.落射式激发时，物镜兼作聚光镜, 就没有聚光镜的定中与调焦问题，而且物镜的数值孔径增大, 荧光图像亮度也随之提高；

2.落射式激发光不必透过载玻片, 因而减少损失；

3.使用正置落射荧光，更便于活体动物的放置和处理。

常见 NIR-II 荧光显微成像技术

NIR-II荧光显微成像术，是将短波红外探测器与传统的荧光显微成像系统结合，可以满足微米级分辨率的成像效果。

1、宽场显微术：

采用激光宽场照射激发，以二维面阵探测接收荧光信号

结合显微镜系统提升其时空分辨能力，拥有相对共聚焦更快的成像速度和相对光片更便捷的实验条件。

优：时空分辨率高，并且操作简便

劣：背景抑制较差

2、共聚焦显微术：

利用共聚焦光阑来减少进入探测器的离焦光

优：对比度高

劣：部分有用信号被遮挡，且所需时间长，成像速度慢

3、光片显微术：

采用探测光路与照射光路的垂直设置来收集激发片层的

信号。

优：对比度高

劣：对样品要求高，需要做光透明

技术优势

成像深度大

利用近红外二区波段在生物组织中散射小、衰减和弥散被抑制的特点，实现了相对可见光和近红外一区更大的成像深度和更高的分辨率。

成像空间分辨率高

借助显微物镜的空间放大能力，不同荧光波段的小鼠脑血管活体近红外二区荧光显微镜成像，可通过滤光片插板的替换，将需要测量部分的分辨率进一步提高。

成像时间分辨率高

利用近红外二区显微影像系统的宽场激发面阵探测的特点，可以对活体生物样品进行动态、实时成像与观测，可实现25帧每秒的成像速度。

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