超分辨率显微镜

     尽管近年来取得了巨大成就，但超分辨率显微镜是一个相对年轻的领域，在这个领域存在着许多混淆。然而，这使得超分辨率显微镜为更广泛的成像应用打开了大门，并且更具有吸引力。

     超分辨率光学显微镜是过去十年生命科学最重大的发展之一，其发展正在进行中，2014年诺贝尔奖授予了埃里克·贝齐格、斯特凡·赫尔和威廉·莫尔纳。进展如此迅速和重要，以至于一些观察家将其称为“分辨率革命”。

     生物医学应用的需求非常广泛，包括高空间和时间分辨率、长采集时间、3D成像、深层组织/体内成像等。使用聚焦光的远场光学显微镜是一种重要的工具，特别是用于研究活细胞和生物体。不幸的是，光学显微镜分辨率是有限的；光的衍射对图像的空间分辨率施加了限制。

     这意味着，例如，细胞蛋白质分布的细节只能在一定程度上可视化。幸运的是，近年来见证了超分辨率远场光学显微镜（纳米显微镜）技术的发展，如STED、RESOLFT、PALM、STORM、GSDIM、SIM或SSIM以及FINCH/CINCH（缩写词定义见文章末尾），所有这些都以不同的方式解决了远场光学显微术空间分辨率有限的问题。

     与传统光学显微镜相比，SIM在空间分辨率方面实现了令人难以置信的双重提高，但STED、RESOLFT、PALM/STORM和SSIM更进一步，将光学图像分辨率的极限推向了纳米级。因此，所有超分辨率技术都开辟了生物医学研究的新途径。

     英国利兹大学阿斯伯里中心的Michelle Peckham教授说：“原则上，这些技术中的任何一种都可以应用于任何样本，以提供‘超分辨率’图像。”。“在实践中，个人的选择将包括染料、探针、抗体或荧光蛋白标签的可用性，以及设备的可用性和易用性。”

     “SIM应用结构化照明，实现了比传统显微镜提高两倍的效果--牛津Wolfson成像中心首席研究员兼科学主任Christian Eggeling教授，英国牛津大学MRC人类免疫学单位，以及德国耶拿弗里德里希-席勒大学和莱布尼茨光子技术研究所的超分辨率显微镜教授表示：“不需要像STED/RESOLFT和PALM/STORM那样进行光切换或闪烁。“因此，SIM可以应用于传统样品、固定或活细胞，甚至3D。

    对于许多生物成像应用来说，两倍就足够了，这使得SIM在空间分辨率和长采集时间之间取得了很好的折衷。但也有缺点。

    缺点是，每一个最终图像需要记录多个图像，这延长了总采集时间，从而降低了时间分辨率，尤其是对于3D记录。尽管如此，SIM的记录时间也在稳步提高，并且出现了越来越多的相关技术，如重新扫描或airy扫描显微镜，每幅最终图像只需要一张图像。特别是，iSIM可以非常快速地获取单个图像，这对于成像细胞内的运动目标非常有用。一般来说，SIM和相关技术是一种很好的折衷方案，可能是核/染色体成像的最佳技术。

二、FINCH/CINCH

    作为超分辨率的全息方法，FINCH也可以在一次拍摄中创建超分辨率图像，并且比一些方法更简单、更便宜。自从它在马里兰州罗克维尔的CellOptic公司发明以来，CellOptic公司的首席执行官Gary Brooker博士已经开发了十多年。他们与该公司的Nisan Siegel博士合作，创建了一种名为CINCH的共焦显微镜，可以在单次曝光中产生100 nm分辨率的共焦超分辨率图像。全固态配置很容易适应现有显微镜。

    FINCH是第一种也是最简单的非相干全息术。现在，通过单双折射透镜，FINCH通过源自物体的两个球面波之间的自干涉，在单光束单捕捉系统中从发射非相干光的物体创建全息图。来自物体中任何一点的光被分为两束，这两束光束被差分相位调制并在公共平面中重新组合，以产生干涉条纹。发表在《自然光子》杂志上的一份报告（doi:10.1038/nphoton.2016.207）强调了FINCH显微镜快速产生多种颜色的超分辨生物图像的能力。

    布鲁克说：“FINCH在其简单易用性方面从其他超分辨率方法中脱颖而出，只需要专门的成像镜头和快速计算，而不需要广泛的照明策略、超大的数据集或有限的染色选项。“FINCH可以提供与SIM类似的分辨率，其速度几乎可以用于任何显微镜应用的活细胞成像。”

三、STED

    与SIM不同，STED在不需要数据分析的情况下提供直接图像。STED不仅简单明了，而且用途广泛，适用于固定细胞和活细胞。原则上，这利用了用于共聚焦/宽视场显微镜的典型标记染料。在实践中，通常使用特定于sted的染料。

“STED技术能够以纳米级分辨率对亚细胞结构进行光学成像。Spectra Physics产品营销高级经理Julien Klein表示：“多光子激发荧光成像提供了固有的光学切片、有限的光漂白和光毒性以及更深的穿透力，这些都是在散射组织中成像的关键优势。

    Spectra Physics提供超快激光，使混合STED显微镜能够将超分辨率和多光子激发（MPE）荧光的优势结合到一个装置中。

    克莱因说：“在一种特定的方案中，通过将飞秒红外1µm激光器（如Spectra Physics的HighQ-2）用于双光子激发，并将可见CW激光器用于耗尽，可以同时获得STED和MPE成像的优势。”

    STED的一个独特特征是，空间分辨率可以根据添加的STED激光的强度进行调整——无论是在2D还是3D，从共焦到原则上无限的尺度。这在图像采集方面提供了更大的灵活性。

    Eggeling说：“例如，如果样品不太亮或样品制备不太准确，可能会牺牲空间分辨率来获得更好的信噪比。”“另一方面，空间分辨率的调整允许独特的应用，如STED- fcs (STED显微镜上的荧光相关光谱)，以前所未有的细节揭示分子的扩散模式。”

    由于所涉及的高激光强度，STED显微镜通常被认为在标签的光漂白和细胞活力方面具有非常强的光毒性。然而，如果在采集模式、标记方案和样品制备方面非常谨慎，越来越多的活细胞应用表明STED显微镜是一种以高空间和时间分辨率观察细胞动力学的合适工具。

    超快激光器也可以用于多种方案，例如创建双光子激发脉冲串或高重复率啁啾耗尽光束。例如，近红外激光器，例如Spectra Physics Mai Tai，可以通过玻璃棒和/或光纤将脉冲持续时间拉伸到数百皮秒来产生用于STED的高重复率脉冲耗尽光束。

     Leica Microsystems公司的Rolf Borlinghaus将STED描述为研究包含真实三维的较厚样品的最佳方法。凭借超分辨率技术LIGHTING和Leica TCS SP8 STED Nanoscope，Leica Microsystems旨在帮助神经生物学、癌症研究和免疫学领域的科学家可视化活细胞中的分子相互作用和结构，以了解生命的真实本质。

    最后，Abberior正在开发一种新的STED仪器，包括用于宽视场显微镜的STED附件（STEDYCON），以及MINIFLUX的尖端方法，该方法承诺分辨率高达1 nm。

四、单分子定位显微镜

    PALM/STORM/GSDIM：这些是不同的缩写词，但每种方法都指向相同的基本原则。它们的受欢迎程度归因于相对容易且成本高效的设置，因为它们可以简单地包括具有灵敏相机的标准全内反射荧光（TIRF）/宽视场显微镜。在普通实验中，它们通常也能达到最高的空间分辨率，可以用传统的染料和特殊的缓冲液进行标记，使它们闪烁，也可以用特殊的光活化或光开关荧光团进行标记。

    PALM/STORM/GSDIM于2006年首次报道，它使用光诱导荧光开关在时间上分离单个分子的空间重叠图像。这允许以高精度确定它们的位置，并且从这些分子位置重建具有亚衍射极限分辨率的图像。

    Eggeling说：“因此，PALM/STORM/GSDIM的分辨率不受衍射的限制，而是受测量分子位置的精度的限制，在某些情况下，还受局部分子密度的限制。”

    缺点包括相当乏味的数据分析，需要记录数百到数千个单独的相机图像来创建最终的超分辨率图像——即，图像采集相当长，因此难以观察更快的活细胞动力学；并且需要低背景噪声，因为单个分离的分子需要被打开、关闭和定位，因此TIRF仍然是优选的采集模式。

    尽管如此，这项技术仍在稳步改进，特别是在自动化、无偏见的数据分析、速度和更深层次的样本成像（例如，通过使用光片）方面。新的软件方法，例如HAWK分析，也可以帮助减少最终图像中的潜在伪影。Eggeling说，最近一种名为MINIFLUX的方法将开辟新的途径，该方法通过使用STED方法的特征来提高定位精度，从而要求更低的光子数。MINIFLUX的工作原理是用激发模式的不同位置对单个荧光分子的位置进行三角测量，从而实现超出使用宽场/TIRF照明的典型PALM/STORM/GSDIM系统的定位精度。

五、RESOLFT：温和的照明有利于活细胞成像

    RESOLFT应用与STED相同的原理，但它也使用特定的可逆、可光切换的荧光标记，如PALM。由于使用了这些标签，可以用比STED低得多的激光强度实现超分辨率。温和的照明允许在纳米尺度上长期记录神经元蛋白及其在细胞和组织中的动力学。

    Eggeling说：“不幸的是，到目前为止，由于可逆光开关荧光标签的可用性有限，其普遍适用性受到了阻碍。”。“但这些都在不断改进，变得越来越可行。”

六、SSIM：有限的应用

    SSIM在SIM上使用可逆光切换来实现比两倍更好的空间分辨率提高。但问题与SIM和RESOLFT相同——除了原理证明之外，适用性仍然有限。

    CSREM或CLEM：电子显微镜和光学显微镜的结合

    CSREM或CLEM将电子显微镜与其他超分辨率技术相结合，通常是STORM或PALM。它只能应用于固定样品和用于识别某些样品区域的标记，要么是金珠或者是盖玻片上的标记。

    利兹大学的Peckham说:“这项技术可能在使用活细胞的超分辨率成像方面很有用——用高分辨率检查特定蛋白质的行为，然后进行快速固定(例如，高压冷冻)，并用电子显微镜成像，在细胞超微结构的背景下研究蛋白质。”

七、现在和未来的画面

    STED, RESOLFT, PALM和STORM现在在越来越多的实验室中常规使用，以探测成像光波长的一小部分长度范围内的透明物质。这些技术的一些应用产生了关于膜纳米结构和神经科学的信息，并用于研究与阿尔茨海默病和亨廷顿病相关的蛋白质聚集机制。

     但是获得更高的空间分辨率是要付出代价的——精确的样品制备和优化的标签变得至关重要。特别是，随着越来越多的人使用更小的纳米体或人工结合蛋白(如Affimers)，传统抗体的大尺寸开始受到限制。

    Eggeling说：“一般来说，使用超分辨率显微镜，需要非常小心地制备样品。在共焦/宽视场显微镜中，不适当的标记，如高背景或不适当的固定，可能会被原谅，但会显著恶化超分辨率图像。”“同样，如果细胞不快乐，它们通常会在超分辨率图像中比传统的共聚焦/宽视场显微镜图像死得更快。”

     有一些技术试图在空间分辨率的提高和设置或分析的复杂性之间提供折衷。几家公司提供的Airy-scan或iSIM显微镜都类似于SIM，并且在传统共聚焦或宽视场显微镜的基础上增加一小部分，就可以实现高达1.7倍的空间分辨率提高。另一方面，有机化学家不断努力提高荧光标记的光子产率是进一步改进的基础。

     根据物理研究所在其《物理杂志D:应用物理》(doi: 10.1088/0022-3727/48/44/443001)上发表的2015年超分辨率显微镜路线图，下一阶段的发展将是将超分辨率显微镜的应用扩展到更广泛的科学问题。从某种意义上说，这意味着显微镜应该能够处理更大范围的标本。

     该路线图由该领域的一些知名人士共同撰写，包括Stefan Hell和Eggeling，强调采用自适应光学来获取更厚的标本将允许在组织应用中更多地使用超分辨率，在发育生物学，神经科学和其他领域具有重大的潜在益处。

    广泛使用自适应光学的另一个优势是超分辨率的可用性增加，因为它为系统的自校准和自动校准提供了机会，从而减少了对内部技术支持的需求。诸如此类的进步将把这些方法转变为普通的实验室工具。

八、解读与超分辨率显微镜相关的缩写词

    超分辨率显微镜是几种超越衍射极限的技术的总称，其中大多数达到纳米尺度。一些例子包括:

SIM:结构照明显微镜

iSIM:瞬时结构照明显微镜

FINCH/CINCH:菲涅耳非相干相关全息术，CINCH是共聚焦版本

STED:受激发射耗尽显微镜

HAWK分析:Haar小波核分析

MINIFLUX:最小光子通量•ModLoc:调制定位

RESOLFT:可逆饱和光学线性荧光跃迁

SSIM：饱和结构照明显微镜

CSREM/CLEM:相关超分辨光学和电子显微镜/相关光学和电子显微镜

PALM/STORM/GSDIM:光激活定位显微镜/随机光学重建显微镜/基态耗尽显微镜

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