分光光度计/光谱仪/透过率/日立/安捷伦

一、概念

       分光光度计，又称光谱仪(spectrometer)，是将成分复杂的光，分解为光谱线的科学仪器。测量范围一般包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围为200～400 nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源.

         分光光度法是根据物质的吸收光谱和光的吸收定律，对物质进行定量、定性分析的一种仪器分析方法。根据测定时所选用的光源分为：

可见分光光度法(400~800nm)

紫外分光光度法(200~400 nm)

红外分光光度法(800nm~50mm)

二、原理

        分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。

        Lambert-Beer定律是吸收光度法的基本定律，表示物质对某一单色光吸收的强弱与吸光物质浓度和厚度间的关系。

I。——入射的单色光强度

I——透射的单色光强度

c——样品浓度

L——光程，即盛放溶液的液槽的透光厚度

k——光被吸收的比例系数

    当浓度采用摩尔浓度时，k为摩尔吸收系数。它与吸收物质的性质及入射光的波长λ有关。

分光光度法的原理

lg(I0/I)=k*c*l

公式的意义：

当I=I0时，lg(I0/I)=0,表示溶液完全不吸收光线；

当I<I0时，lg(I0/I)值大，表示溶液吸收光线较多；

当I趋于0时，lg(I0/I)值无穷大，表示光线几乎被溶液完全吸收，即溶液不透光。

由此可见，lg(I0/I)表示溶液对光吸收的程度，称作吸光度(absorbance)，

用A表示，即A=lg(I0/I)

        当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时, 其吸光度与吸光物质的浓度c及吸收层厚度L成正比.

        物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。

三、分类

按波长分为：

1、可见光分光光度计：测定波长范围为400～760nm的可见光区；

2、紫外分光光度计：测定波长范围为200～400nm的紫外光区；

3、红外分光光度计：测定波长范围为大于760nm的红外光区；

4、荧光分光光度计：用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱；

5、原子吸收分光光度计：光源发出被测的特征光谱辐射，被经过原子化器后的样品蒸气中的待测元素基态原子所吸收，通过测定特征辐射被吸收的大小，来求出被测元素的含量。

紫外可见分光光度计(200-1000nm)是目前市面上比较流行的，紫外可见分光光度计根据光路可划分为：

单光束分光光度计

双光束分光光度计

双波长分光光度计

四、主要部件

1、光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度。

a 可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)

b 紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)

2、单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。

3、棱镜:玻璃350～3200nm,石英185～4000nm

4、光栅:波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便。

5、吸收池：(比色皿)用于盛待测及参比溶液。

a 可见光区：光学玻璃池

b 紫外区：石英池

6、检测器：利用光电效应，将光能转换成电流信号。

光电池，光电管，光电倍增管

7、指示器：

a 低档仪器：刻度显示

b 中高档仪器：数字显示，自动扫描记录

五、应用

分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。

核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。

蛋白质的直接定量（UV法）：比色法蛋白质定量，蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。

细菌细胞密度：实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。

个人经验：可用于测相衬观察术中的相衬板批量生产时的透过率，从而间接在测量相位稳定性。

六、品牌

1、日本日立

2、安捷伦

Thermo

德国耶拿

美国哈希（HACH）

日本岛津

美国珀金埃尔默

上海美谱达

上海棱光技术

上海元析仪器

北京普析通用

北京北分瑞利

上海奥普乐

海能

上分

七、紫外可见与可见光分光光度计的区别

紫外可见分光光度计与可见分光光度计的区别是测定波长范围不同，紫外一般用氢灯，测定波长范围180～350nm,可见一般用钨灯，测定波长范围320～1000nm。

所谓紫外可见分光光度计也就是说这个仪器可以更换光源，能够测定吸收峰在紫外和可见光部分的化合物。

发现吸光度超过2，便不再显示，是正常现象。吸光度是透光率的负对数，吸光度超过2就是说透光率小于1％，低于仪器的检出限，就不再显示了。

八、影响选型的因素

1、波长检测范围，波长选择方式（手动查找、自动查找或扫描）

2、光束：光束类型分为单光束型，双光束型或准双光束型（单光束一般适于在给定波长处测量吸光度，不能作全波段光谱扫描，并且要求光源和检测器具有很高的稳定性；双光束可以自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析；假双光束也就是比例双光束，优点是可以监测光源变化带来的误差，它的原理是由同一单色器发出的光被分成两束，一束直接到达检测器，另一束通过样品后到达另一个检测器。但是这种方式并不能消除参比造成的影响。

3、光源：可见光区主要用钨灯，卤钨(320～2500nm)；紫外区主要用氢灯，氘灯(180～375nm)；氙灯在紫外和可见光区均可用作光源。

4、样品支架：简单的样品支架为推拉式四联池架，一次只能测量一个样品，参比和样品分两次测量；高档型的样品池支架为两个固定式，分别是样品通道和参比通道，可以同时测量参比和样品的吸光值。

5、狭缝：简易型的狭缝一般是固定宽度模式，狭缝宽度多数为2nm,也有1.5nm的；高档型的仪器狭缝均为连续可调型，可以适应高分辨率的需要。

6、光学性能指标：光学性能的高低直接影响到测量的准确性，其中光栅的技术指标尤为重要。高档型仪器的光栅质量较好，一般最佳的光栅为凹面型，并且大尺寸的凹面光栅对应的刻槽数越多，因此在分辨率和杂散光方面指标要优于简易型仪器。

7、检测器：检测器是利用光电效应，将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号放大的装置。简易型仪器一般采用光敏二极管；中档型仪器采用硅光二极管；高档型仪器的检测器使用高灵敏度的光电倍增管和红外检测器。

8、显示器：简易型仪器多为机械表头或数码管显示器，没有数据处理器；高档型仪器的显示器为液晶式或连接电脑，数据处理可

由仪器自身具有的或外接计算机处理。

9、测量模式：简易型仪器多为定点(固定波长)吸光度或透过率测量方式，基本不能进行波长扫描测量；高档型仪器的测量模式较多，可以显示透过率、吸光度、浓度直接读数、单光束，单点及扫描均可。

10、测量附件：衡量仪器质量高低的重要方面是看仪器是否具有丰富的附属测量器件，如偏振附件、积分球附件、反射附件、自动进样器附件、色度分析软件、薄膜附件。

11、测量样品的状态：可见和紫外的分光光度计一般测量液态样品，红外分光光度计一般能分析各种状态(气、液、固)的试样。

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