DIC显微镜元件对准教程

微分干涉衬度 ( DIC ) 光学元件的正确调整和对准对于成像性能至关重要，因此显微镜技术人员必须认识到未对准和元件不匹配，并采取必要的步骤来纠正这些错误。本交互式教程在各种配置图案下检查 DIC 显微镜中的锥光和正交视场，并讨论了为实现令人满意的显微镜对准而推荐的许多重要方面。

本教程首先将虚拟 DIC 显微镜置于锥光观察模式（模拟虚拟相位望远镜或伯特兰透镜），并且仅将偏振器和分析器（传输轴交叉）插入光路。此外，初始化时聚光镜光圈已关闭至其最宽孔径尺寸的 80%。要操作本教程，首先从位于视口左侧的成像模式单选按钮组中选择一种 DIC 技术， Nomarski或de Sénarmont 。接下来，从物镜放大倍率中选择一个物镜下拉菜单（默认为 10x）。请注意，当选择新物镜时，在显微镜视口中观察到的聚光器孔径光阑的尺寸会成比例地增加或减小。使用聚光镜光阑滑块更改孔径光阑的开口尺寸。

要在光学系统中安装诺马斯基棱镜，请使用物镜棱镜或聚光棱镜单选按钮。当选择这些单选按钮之一时，视口会显示单个诺马斯基棱镜的锥光图像，其大小根据物镜选择而变化。如果已选择物镜棱镜，滑块将更改以显示文本：物镜棱镜平移（当显微镜处于Nomarski模式时）或偏振器方向（当显微镜处于de Sénarmont模式时）。如果选择聚光棱镜，则偏振器方向当显微镜处于de Sénarmont模式时，将显示文本，但当显微镜处于Nomarski模式时，滑块将停用。

在Nomarski或de Sénarmont成像模式下，滑块可用于改变引入光学系统的偏置延迟。在Nomarski模式下（仅当选择物镜棱镜时），物镜棱镜平移滑块最初位于中心位置，不添加任何偏置。将滑块向右平移会产生负偏差，而将滑块向左移动则会产生正偏差。本教程在de Sénarmont模式下的操作方式相同，不同之处在于可以选择任一棱镜，并且偏振器方向滑块还指示偏振器从中心位置旋转的度数。

要将两个棱镜（聚光镜和物镜）添加到虚拟 DIC 显微镜光学系统中，请在Nomarski或de Sénarmont成像模式下选择“两个棱镜”单选按钮。然后可以使用物镜棱镜平移（Nomarski 模式）或偏振器方向（de Sénarmont 模式）滑块调整偏差。为了将一阶补偿板添加到光路中，请在补偿器复选框中勾选复选标记。在上面讨论的所有情况下，虚拟 DIC 显微镜都可以通过选择正交模式置于正交模式。单选按钮。然后，视口将显示当虚拟伯特兰透镜从光路中移除时场的显示方式。

微分干涉对比显微镜对准

在尝试配置显微镜以进行微分干涉对比观察之前，请检查仪器以确定是否存在所有必要的组件，并且没有棉绒、灰尘和碎片。包含应力特征的物镜和聚光镜元件可能会降低 DIC 中的图像质量，就像弄脏镜片表面、划痕以及光路中的异物污染一样。显微镜的正确对准对于获得最佳结果和生成显示伪三维和阴影投射效果的图像至关重要。以下过程中概述的许多步骤仅在首次对准 DIC 显微镜时才需要，日常观察不需要重复。每次使用显微镜进行 DIC 研究时都应采取其他步骤。

初步显微镜检查- 仔细检查显微镜，确保所有必要的 DIC 组件均已安装，或在必要时可用并可供使用。拆下聚光镜，拆卸转塔，然后检查诺马尔斯基或沃拉斯顿棱镜的状况。这些复合棱镜的表面应清洁、无灰尘和碎屑。由于 DIC 聚光镜棱镜安装在聚光镜转台内，因此很少会受到指纹污染，但灰尘和棉绒很容易流入转台并落在其中一个平坦的石英表面上。要清洁受污染的棱镜表面，请使用橡胶气球去除松散的纤维和灰尘，和/或用镜头纸或湿润的软棉轻轻擦拭表面。小心不要刮伤表面。对物镜棱镜也应进行同样的处理，聚光镜和物镜外部透镜元件、显微镜目镜以及显微镜底部视场光阑端口处的场镜（或连接到倒置显微镜的立柱上）。确保关键部件清洁后，重新组装显微镜，安装偏振器和分析器，然后对准科勒照明的光学系统。

安装偏振器和检偏器- 拆卸显微镜（聚光镜、DIC 棱镜和至少一个物镜被拆除），将偏振器和检偏器分别安装在聚光镜下方和物镜上方的位置。以类似于偏振光显微镜的方式，偏振器和检偏器的位置使其传输方位角彼此成 90 度角（垂直）。偏振器安装在光源和聚光镜之间，传统上沿东西方向定向，或者在面对显微镜时从左到右定向。在某些情况下，偏振器和检偏器的位置都是由它们在安装框架中的固定位置预先确定的，并且这些组件只能以单一方向插入显微镜光学路径中。通常，偏振器安装座上的标记指示传输方向，但有些显微镜配备了以度为单位的旋转偏振器安装座。分析仪还可以通过带刻度的旋钮来旋转，和/或可以包含指示传输轴的标记。

图 1 - 微分干涉对比中的物镜后孔径

当偏振器和检偏器交叉时（透射轴以 90 度角定向），通过目镜观察时，视场显得非常暗。这种情况被称为最大灭绝。如果大量光穿过显微镜并且视场不暗（或几乎黑色），请检查以确保偏振器和检偏器交叉。穿过偏振器后，插入聚光镜和物镜，但不要安装物镜诺马斯基棱镜滑块（或固定安装座）。将聚光镜转塔旋转到明场位置（缺少相位板或 DIC 棱镜的插槽）。视场应保持黑暗，但如果这些组件（聚光镜或物镜）中的任何一个包含应变透镜元件，则一些光可能会穿过。在进行下一步之前，从光学系统中取出一个偏振元件（偏振器或检偏器）。

建立科勒照明- 在进行 DIC 配置之前（安装偏振器后），应使用标准科勒技术对准显微镜光学系统，以便进行明场标本观察。配置正确后，光源（通常是卤钨灯）的图像应通过灯箱中的聚光透镜或沿着显微镜框架底座内的光学系统投射到聚光镜孔径光阑平面上。同时，聚光镜系统还将视场光阑的图像投影到样本共轭平面（在显微镜阶段）。灯丝居中后（大多数现代灯箱包含预先居中的灯），关闭聚光镜孔径光阑，并在明场照明下将聚光镜与显微镜光轴对齐（聚光镜转塔设置为0或B位置）。将隔膜置于焦点上，使用 10 倍物镜叠加在聚焦样本上，然后打开虹膜叶，直到在视场的外围边缘仅可见隔膜的一小部分。对于所使用的每个物镜都采取类似的步骤，通过调整视场光阑和孔径光阑，确保显微镜正确配置为每个物镜的科勒照明。在 DIC 的日常观察过程中，应定期检查显微镜以确保保持科勒照明。

检查物镜后孔径- 将显微镜配置为科勒照明后，插入偏振器和检偏器，并使用相位望远镜或伯特兰透镜（锥光观察模式）检查物镜后焦平面。如果偏振器和检偏器位置正确且显微镜完美对准，则物镜孔径中将出现暗消光十字，如图 1(a) 所示。消光十字臂应垂直和水平放置，孔径的四个角出现少量光线（图 1(a)）。十字或高双折射区域中的亮点会影响消光十字的完整性，是光学器件应变的指标。此外，当在物镜后孔径处观察时，位于共轭孔径焦平面（聚光镜或物镜）附近的灰尘和棉绒颗粒将显得明亮。如果存在双折射斑点，请检查另一个无应变的物镜，以确定第一个物镜或聚光透镜系统是否有应变。在继续下一步之前，清除物镜或聚光镜表面上的所有污染灰尘，并更换损坏的光学元件（如果可能）。

物镜 DIC 棱镜对准- 通过插入滑块或限制在固定安装座上的棱镜来安装物镜棱镜（适用于利用 de Sénarmont 偏置延迟的系统）。一旦棱镜就位，用相位望远镜或伯特兰透镜再次检查物镜后焦平面。视场现在应该显得非常明亮，但没有特征，有一条暗干涉条纹沿剪切轴以 45 度角延伸穿过孔径直径（参见图 1(b) ）。根据显微镜是正置还是倒置，干涉条纹将以东北-西南（正置）或西北-东南（倒置）方向穿过物镜后孔径。无论哪种情况，干涉条纹都应清晰可见，如图 1(b) 所示，并位于孔径的中心。

在某些 DIC 显微镜设计中，物镜棱镜是固定的（塞纳蒙补偿），而在其他设计中，棱镜可以通过滑块框架中的定位螺钉机构在光轴上来回平移。在后一种情况下，请一边通过望远镜或伯特兰透镜观察物镜后焦平面，一边慢慢旋转调节旋钮。转动旋钮时，干涉条纹应从其中心位置移至明亮后孔的上半部分或下半部分。或者，转动 de Sénarmont 补偿器中的偏振器也会产生相同的效果。

图 2 - 微分干涉对比中的正偏差和负偏差

聚光镜 DIC 棱镜对准- 从光学系统中取出物镜棱镜，然后通过旋转聚光镜转塔将最低孔径的聚光镜棱镜（与 10 倍物镜一起使用）摆动到位。适当的位置通常用炮塔上的红色或白色10设置来标记（或类似的代码，例如L）。重新调焦相位望远镜或伯特兰透镜，观察物镜后焦平面中出现的干涉条纹。再次，应存在与物镜棱镜产生的条纹具有相同方向的单个条纹（正置显微镜为东北-西南，倒置显微镜为西北-东南）。聚光镜和物镜棱镜的干涉条纹应该看起来几乎相同，并且沿着剪切轴应该具有相同的方向。

为了使用油浸式高数值孔径聚光镜清楚地观察聚光棱镜干涉条纹，可能需要使用摆动镜头控制杆拆下前镜头组件。如果物镜孔径中出现的条纹位置不正确，则可能需要调整聚光棱镜的方向或对准。在大多数情况下，聚光镜棱镜组装在带有凹口或销（或锁定螺钉）的保护性圆形铝框架中，以确保在聚光镜转塔内正确定位。有时，聚光棱镜可能会在没有正确对准的情况下被强行放入转塔中，这在检查干涉条纹时会很明显。如果聚光棱镜似乎未对准，请向显微镜制造商咨询有关正确调整聚光镜 DIC 棱镜的说明。

标本观察- 将显微镜对准科勒照明，偏振器和分析器交叉，并安装两个棱镜（物镜和聚光镜），将薄的透明安装样本（例如颊上皮细胞制剂）放在载物台上。调整显微镜以获得最大消光，并在正交模式下通过目镜观察过程时聚焦样本（无伯特兰透镜或相位望远镜）。在视场中观察到的图像应呈现非常深的灰色，几乎黑色，在最大消光时，在具有明确定义的厚度或折射率梯度的区域（例如，细胞膜和细胞核；参见图 2(b)）具有明亮的高光。具有高折射率的球形样本，例如浸没油滴，甚至可以充当微小的透镜，并出现清晰界定的干涉条纹或带，该干涉条纹或带穿过中心区域，其方向与在物镜后孔径中观察时的条纹方向相同。

在观察聚焦的样本图像时，使用滑块旋钮平移物镜 DIC 棱镜或在配备 de Sénarmont 补偿的显微镜中旋转偏振器（或分析器）。此操作称为引入偏置延迟，并将沿剪切轴平分样品的干涉条纹，并对样品外观产生相应的变化。向一个方向移动棱镜（正偏压）将使一侧边缘的样本特征变亮，同时使另一边缘的相同特征变暗，同时使背景变亮（见图 2(a)）。一般来说，样本呈现伪三维外观，具有与剪切轴方向相同的阴影投射效果。将棱镜移至显微镜光轴的另一侧（负偏压）将反转标本的明暗区域（比较图 2(a) 与图 2(c)）。

在正确安装和对齐所有 DIC 组件的最大消光情况下，当使用相位望远镜或伯特兰透镜观察时，物镜后孔径呈现深灰色（几乎黑色）且相对均匀（图 1(c)）。在大多数情况下，后孔的中心区域呈深黑色，而外围的四个象限中出现一些光的迹象。消光十字通常看起来与单独使用交叉偏振器观察到的非常相似，但通常更暗并且覆盖物镜后孔径的更大区域。外围周围的明亮区域（图 1(c)）是由于聚光镜和物镜中的偏振器和透镜元件表面的光部分去偏振而产生的伪影造成的。

通过屏蔽物镜后孔消光十字周边的明亮区域，可以显着改善微分干涉衬度图像。这是通过减小聚光镜孔径光阑的尺寸以消除亮边来实现的。一般来说，物镜后孔径尺寸应随光阑减小至全孔径的大约 75% 或 80%。当光学系统完美对准时，消光十字呈直立状态（见图 1），并且可以观察到由两条宽干涉条纹组成，每条干涉条纹均呈直角形状，并在物镜后孔径的中心相遇（干涉条纹也可以在低质量显微镜中以正交模式可视化）。在某些显微镜上，可以调整聚光镜和物镜棱镜的位置以产生更均匀的条纹图案，从而使孔径的中心区域显得更暗且更均匀。这项任务是通过松开和旋转（或升高或降低）聚光棱镜或将偏振器和检偏器分开几度来完成的。有时显微镜会包含固定螺丝，可以调整聚光镜和物镜棱镜，但配备这种设备的型号越来越少。作为显微镜对准的最后检查，调整聚光镜聚焦旋钮，同时检查物镜后孔径中的消光图案，以确定是否可以改进。请注意，对聚光镜进行大幅重新定位可能会分离物镜和聚光镜 DIC 棱镜的共轭干涉面之间的重叠部分，从而降低光学性能。

通过平移物镜棱镜或以 de Sénarmont 配置旋转偏振器来调整偏置延迟，可显着改善图像外观（超过在最大消光时观察到的图像外观）并增加对比度。这种操作对于以微分干涉对比对样本进行成像至关重要，并且代表了显微镜光学系统调整的最后一步。在许多情况下，观察 DIC 图像时，整个视野中都会出现光梯度。除了在样本的相对边缘处存在光强度和暗强度之外，还会发生这种情况，并且是由于光学系统产生的宽且模糊的场条纹伪影造成的。具有匹配良好的光学元件的显微镜可以最大限度地扩大视场条纹的尺寸，它可以变得如此广泛和均匀分布，以至于整个区域呈现均匀的中灰色。然而，在大多数情况下，边缘的一些证据仍然存在，并且视场从一个外围边缘到另一个外围边缘呈现出浅的光强度梯度（中到浅或深的灰色阴影）。这种伪影是特定光学配置所固有的，在观察和收集 DIC 样本图像时应忽略该伪影。

DIC 显微镜中的补偿器

通过在 DIC 显微镜的光路中引入延迟板（或补偿器）也可以增加样本对比度。通常，全波（也称为一阶补偿器）板插入物镜棱镜和分析器之间的中间管中，尽管该板也可以位于偏振器之后但聚光棱镜之前。这些板在绿色区域（通常接近 550 纳米）的指定值处表现出整个波长的延迟水平，并导致样本沿着折射率和厚度梯度显示黄色和蓝色牛顿干涉色。由于从白光中减去了绿色波长，背景呈现为洋红色。

图 3 - 带一阶补偿器的 DIC 中的物镜后孔径

在 de Sénarmont 或标准（可翻译）Nomarski 棱镜 DIC 显微镜配置中，当物镜棱镜的消光干涉条纹位于光路中心时，会在以下位置观察到类似于图 1(b) 中显示的图案：物镜后焦平面（假设聚光棱镜已从光路中移除）。如果将全波延迟板放置在物镜棱镜和分析器之间，则图 3（a）所示的干涉图案（显示牛顿干涉色光谱）出现在物镜后焦平面中。从光路中移除物镜棱镜并插入聚光棱镜会产生如图 3(c) 所示的图案。当物镜和聚光棱镜都出现在光学系统中并调整到消光位置时，在物镜后焦平面中可以看到洋红色（图 3(b)）。

平移物镜诺马斯基棱镜或旋转 de Sénarmont 补偿器配置中的偏振器将改变图 3(b) 所示的牛顿干涉图案颜色。引入负偏差会将牛顿颜色转变为减色值（黄色），而将棱镜转变为正偏差值将导致加色（蓝色）。可以将样本梯度产生的颜色与 Michel-Levy 参考图进行比较，以确定光程差的大小。

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